TITLE: Process for the performance of immunodiagnostic assays.
European Patent Application EP0597359 A1

ABSTRACT:
Immunodiagnostic assays, in which enzymes or antigens are bound to
porous support materials, can be performed such that macroporous
polymer membranes are employed as porous support materials and are
prepared by (a) dispersing an insoluble filler in a solution which
contains at least two incompatible polymers in amounts which lead to a
phase separation in the solution, a homogeneous casting solution being
formed, and (b) applying this solution to a support and performing a
precipitation coagulation.

INVENTORS:
Brandt, Dr. Heinz-dieter (DE)
Dhein, Dr. Rolf (DE)
Hildenbrand, Dr. Karlheinz (DE)
Stoecker, Dr. Roland (DE)

APPLICATION NUMBER: EP19930117747
PUBLICATION DATE: 05/18/1994
FILING DATE: 11/02/1993

ASSIGNEE: BAYER AG (DE)
INTERNATIONAL CLASSES: C08J3/14; C08J3/16; C08J9/00; C12N11/08; C12N11/12; C12Q1/00;
G01N33/543; G01N33/545; (IPC1-7): G01N33/545; C12N11/08; C12Q1/00
EUROPEAN CLASSES: C12N11/08; C12N11/12; G01N33/543K; G01N33/543K4; G01N33/545

DOMESTIC PATENT REFERENCES:
EP0186347 Method for producing high-active biologically efficient
 compounds immobilized on a carrier.
EP0225535 Cross-linked copolymers in pearl form containing epoxy and
 basic amino groups, process for their preparation and their use.

FOREIGN REFERENCES:
WO/1986/007345A1 STRUCTURED SILICAS

OTHER REFERENCES:
CHEMICAL ABSTRACTS, Band 107, Nr. 21, 23. November 1987, Columbus,
Ohio, USA P. HERMANN et al. "Immobili- zation of proteins on macro-
porous polymeric carriers: use of salts to increase covalent coupling."
Seite 389, Nr. 194 164c; & DD-A-242 240

CLAIMS:
1. Verfahren zur Durchf·uhrung immundiagnostischer Nachweise, bei
welchen Enzyme oder Antik·orper auf por·osen Tr·agermaterialien
gebunden werden, dadurch gekennzeichnet, dass als por·ose
Tr·agermaterialien makropor·ose Polymermembranen eingesetzt werden, die
hergestellt werden, indem man a) in eine L·osung, die wenigstens zwei
unvertr·agliche Polymere in solchen Mengen, die zu einer Phasentrennung
der L·osung f·uhren, enth·alt, unl·osliche F·ullstoffe eindispergiert,
wobei eine homogene Giessl·osung entsteht, und b) diese L·osung auf
einen Tr·ager aufbringt und eine F·allungskoagulation durchf·uhrt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder
mehrere F·ullstoffe aus der Gruppe von Talkum, Titandioxid,
Bariumsulfat, Siliciumdioxid, mikrokristalline Zellulose, Zeolithe und
Bentonite, hochdisperse Kiesels·auren und Quarz, die organisch
modifiziert sein k·onnen, eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
F·ullstoffe je nach spezifischer Oberfl·ache in Mengen von 5 bis 500
Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der organischen Substanz der
Membran, eingesetzt werden, wobei bei hochdispersen F·ullstoffen
vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-% und bei F·ullstoffen mit geringeren
spezifischen Oberfl·achen vorzugsweise 35 bis 500 Gew.-% eingesetzt
werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
wenigstens zwei unvertr·aglichen Polymere ausgew·ahlt sind aus den
Kombinationen a) Celluloseester/Polyvinylester, b)
Polyurethan/Polyacrylate bzw. Acrylcopolymere, c)
Polycarbonat-Copolymere/Polyurethan, d) Polyvinylderivate/Polysulfone,
e) Polyamide bzw. Polyimide/Polystyrol bzw. Styrolcopolymere und f)
Poly-para-dimethyl-phenylenoxid/Polyvinylidenfluorid, g)
Polysulfon/Polyacrylnitril h) Polyethersulfon / anionisch modifiziertes
Polyacrylnitril wobei weitere Kombinationen innerhalb der
Polymerkombinationen m·oglich sind und wobei auch tern·are
Polymergemische aus den genannten Polymeren eingesetzt werden k·onnen.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
makropor·ose Polymermembran ein integriertes Chromogen, bevorzugt das
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, enth·alt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
makropor·osen Polymermembranen eine durch freie Aminogruppen
modifizierte Oberfl·ache aufweisen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur
kovalenten Bindung der Enzyme oder Antik·orper an eine makropor·ose
Membran mit einer durch freie Aminogruppen modifizierten Oberfl·ache
Bisulfit-Addukte von Isocyanaten eingesetzt werden.

DESCRIPTION:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchf·uhrung
immundiagnostischer Nachweise, bei welchen Enzyme oder Antik·orper auf
por·ose Tr·agermaterialien gebunden werden. Das erfindungsgem·asse
Verfahren ist gekennzeichnet durch den Einsatz makropor·oser
Polymermembranen als solche por·osen Tr·agermaterialien. Die
makropor·osen Polymermembranen werden hergestellt, indem man aus einer
L·osung, die wenigstens zwei unvertr·agliche Polymere in solchen
Mengen, die zu einer Phasentrennung in der L·osung f·uhren, enth·alt,
durch Eindispergieren eines unl·oslichen F·ullstoffes, eine homogene
Giessl·osung bereitet, diese L·osung auf einen Tr·ager aufbringt und
dann eine F·allungskoagulation durchf·uhrt.
Por·ose Tr·agermaterialien, die biologisch aktive Proteine, wie Enzyme
oder Antik·orper, binden, spielen in verschiedenen Bereichen der
Technik sowie in der klinischen Diagnostik eine wichtige Rolle. Den
Immunoassay-Methoden kommt dabei eine besondere Bedeutung zu. Am
meisten werden kompetitive Bindungstests (RIA, EIA) sowie
Sandwich-Tests (IRMA, ELISA) benutzt, wobei die ELISA-Tests eine
zunehmende Bedeutung erlangen. Beim ELISA-Test (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) wird das zu bestimmende Antigen von einem
tr·agergebundenen Antik·orper (prim·arer Antik·orper) gebunden und
durch einen enzymatischen Zweitantik·orper (sekund·arer Antik·orper)
quantitativ bestimmt.
Das Grundprinzip dieser Nachweismethoden ist in zahlreichen
Publikationen beschrieben (Angew. Chemie 97 (1985), 141-163; Chimia 29,
(3) (1975), 109). Die Immobilisierung (Bindung) des prim·aren
Antik·orpers an der por·osen Matrix-Oberfl·ache kann prinzipiell auf
zwei unterschiedliche Arten erfolgen, n·amlich durch Adsorption oder
kovalente Bindung, wobei beide Verfahren Vor- und Nachteile besitzen.
W·ahrend bei der Adsorption die Gefahr der Denaturierung der
biochemischen Wirkstoffe gering ist, besteht bei der Testdurchf·uhrung
die Gefahr des Auswaschens oder Ausblutens; beim kovalenten Verfahren
ist es gerade umgekehrt. Deshalb wird es angestrebt, je nach
Anwendungsbeispiel und Testverfahren alternativ (sowohl adsorptiv als
auch kovalent) verfahren zu k·onnen.
Der Nachweis der immunchemischen Testreaktion erfolgt beim
ELISA-Verfahren h·aufig durch eine chromogene Reaktion, die durch ein
Enzym, das sich am sekund·aren Antik·orper befindet, katalysiert wird.
So werden beispielsweise h·aufig sekund·are, mit Peroxydase (POD)
markierte Antik·orper eingesetzt, die in Gegenwart von H2O2 eine
Oxidationsreaktion ausl·osen, wobei ein Farbumschlag erfolgt. Das
Chromogen wird im Laufe der Testprozedur in die Matrix impr·agniert,
wobei im Falle von POD-katalysierten Reaktionen h·aufig das bekannte
wasserl·osliche Trinder-System
4-Aminoantipyrin/2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzol-sulfonat (H.V. Bergmeyer,
Methods of Enzymatic Analysis, Vol. I, 3rd. ed., Verlag Chemie)
verwendet wird.
Andere Enzym-/Chromogen-Systeme sind: Alkalische
Phosphatase/p-Nitrophenylphosphat oder beta
-Galactosidase/o-Nitrophenylgalactosid. Auf dem Markt werden
Membransysteme f·ur die Immundiagnose beispielsweise von den Firmen
Millipore (Produkt: Immobilon TM ) oder PALL (Produkt: Immunodyne TM )
in Kombination mit Brosch·uren, die den Testablauf beschreiben,
angeboten. Der Gesamttest besteht aus mehreren Inkubations- und
Waschschritten, wobei die Fixierung des prim·aren Antik·orpers in der
Regel durch kovalente Bindung erfolgt. Zur Testdurchf·uhrung werden
Mikrotiterplatten oder Dot-Blot-Apparaturen, beispielsweise von der Fa.
Bio Rad angeboten. Kritisch bei der Testdurchf·uhrung sind Auswasch-
und Ausblutprobleme, wobei im Rahmen von mehreren Impr·agnier- und
Waschschritten die zuvor eingebrachten Substanzen und Wirkstoffe wieder
ausgewaschen werden k·onnen.
Das ist insbesondere kritisch bei den bisher eingesetzten Chromogenen,
die in der Regel nicht kovalent gebunden werden k·onnen und wegen ihrer
oft guten Wasserl·oslichkeit bei den anschliessenden Waschprozeduren
betr·achtlich extrahiert werden.
Dadurch werden die Messergebnisse h·aufig verf·alscht und die
Empfindlichkeit reduziert.
Es war daher w·unschenswert, Membranmatrizen f·ur immunchemische
Nachweisreaktionen zur Verf·ugung zu haben, die sich besonders f·ur das
ELISA-Verfahren eignen und die folgende Merkmale aufweisen: a)
M·oglichkeit sowohl zu adsorptiven als auch kovalenten Immobilisierung,
b) einfache und schonende M·oglichkeit zur kovalenten Immobilisierung
und c) verbesserte Fixierung des Chromogens zur weitgehenden
Verhinderung des Ausblutens der Reaktionsfarben.
Es wurde nun ·uberraschenderweise gefunden, dass makropor·ose Membranen
aus Polymer-Blends, die in DE-OS 38 09 523 beschrieben sind,
hervorragend f·ur Immundiagnostische Nachweisverfahren geeignet sind.
Es wurde ein Verfahren zur Durchf·uhrung immundiagnostischer Nachweise,
bei welchen Enzyme oder Antik·orper auf por·osen Tr·agermaterialien
gebunden werden, gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als
por·ose Tr·agermaterialien makropor·ose Polymermembranen eingesetzt
werden, die hergestellt werden, indem man a) in eine L·osung, die
wenigstens zwei unvertr·agliche Polymere in solchen Mengen, die zu
einer Phasentrennung in der L·osung f·uhren, enth·alt, unl·osliche
F·ullstoffe eindispergiert, wobei eine homogene Giessl·osung entsteht,
und b) diese L·osung auf einen Tr·ager aufbringt und eine
F·allungskoagulation durchf·uhrt.
Werden beispielsweise eine 20 Gew.-%ige L·osung von Polyurethan in
Dimethylformamid (PU/DMF-L·osung) und eine 20 Gew.-%ige L·osung von
Polyacrylnitril in Dimethylformamid (PAN/DMF-L·osung) unter R·uhren
vermischt, so kommt es nach kurzem Stehen zur Phasenseparation.
Derartige Gemische sind instabil und als Giessl·osungen f·ur die
Membranherstellung nicht geeignet.
Vereinigt man dagegen dieselben Polymer/DMF-L·osungen unter
gleichzeitigem oder nachtr·aglichem Eindispergieren von F·ullstoffen,
beispielsweise von Talkum, so erh·alt man homogene, stabile
Giessl·osungen, die f·ur die Membranherstellung nach der Methode der
F·allungskoagulation geeignet sind. Die aus derartigen Giessl·osungen
hergestellten Membranen zeigen ·uberraschenderweise im Vergleich zu den
bekannten deutlich gr·ossere Poren an der Oberfl·ache, eine sehr viel
h·ohere Gesamtporosit·at und eine deutlich erh·ohte Saugf·ahigkeit, die
vergleichbar ist mit der der Chromatographiepapiere.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen vom Querschnitt dieser
Polymermembranen zeigen, dass es sich um Strukturen mit einem
filzartigen Aufbau handelt, w·ahrend der asymmetrische Strukturaufbau
mit der dichten Polymerhaut an der Membranoberfl·ache fast vollst·andig
zur·uckgedr·angt ist. An der Membranoberfl·ache sind bei einer Membran
des beschriebenen Aufbaus Porendurchmesser von bis zu 30 mu m zu
erkennen.
Die zur Herstellung derartiger makropor·oser Membranmatrizen
erforderlichen Polymergiessl·osungen m·ussen die folgenden Bedingungen
erf·ullen: Die L·osungen der einzelnen Polymerkomponenten d·urfen nicht
miteinander mischbar sein. Bei miteinander mischbaren Systemen werden
in Analogie zu bisher bekannten Giessl·osungen mikropor·ose
Membranstrukturen mit ausgepr·agter asymmetrischer Struktur erhalten;
die L·osungsmittel der einzelnen Polymerkomponenten m·ussen miteinander
mischbar sein; um die nicht mischbaren Polymerkomponenten in homogene
Giessl·osungen zu ·uberf·uhren, m·ussen geeignete unl·osliche,
beispielsweise anorganische F·ullstoffe eindispergiert werden.
Als F·ullstoffe kommen beispielsweise in Frage: Talkum, Titandioxid,
Bariumsulfat, Siliciumdioxid, mikrokristalline Zellulose, Zeolithe,
Bentonite, Calciumcarbonat, Magnesiumcarbonat, Zinkoxid, Eisenoxide,
bevorzugt Talkum, Titandioxid, Bariumsulfat, hochdisperse Kiesels·aure
(beispielsweise Aerosile, Fa. Degussa), Quarz, mikrokristalline
Zellulose, Zeolithe und Bentonite. Derartige anorganische und
organische F·ullstoffe sind marktg·angig. Nicht alle genannten
F·ullstoffe sind f·ur alle Polymerkombinationen gleichermassen
geeignet. So sind beispielsweise Giessl·osungen aus
Polyurethan/Polyacrylnitril-Gemischen mit Titandioxid oder Bariumsulfat
weniger stabil und zeigen eine erkennbare Inhomogenit·at, w·ahrend
L·osungen aus derselben Polymerkombination mit Talkum eine gute
Homogenit·at und Dispersionsstabilit·at ergeben. Es k·onnen auch
Gemische mehrerer der genannten F·ullstoffe eingesetzt werden.
Die Oberfl·ache der eingesetzten F·ullstoffe kann ggf. organisch
modifiziert sein. Beispielsweise sind hydrophobierte hochdisperse
Kiesels·auren (Aerosil R 972 TM , Fa. Degussa) oder aminmodifizierte
Typen kommerziell erh·altlich.
Die Menge der eingesetzten F·ullstoffe ist abh·angig von deren
spezifischen Oberfl·achen, liegt jedoch allgemein im Bereich von 5 bis
500 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der organischen Substanz der
Membran. Bei hochdispersen F·ullstoffen, beispielsweise Aerosil 200 TM
(200 m<2>/g) sind Mengen im Bereich von 5 bis 50 Gew.-%, bezogen auf
das Gewicht der organischen Substanz der Membran, ausreichend. Bei
F·ullstoffen mit geringeren spezifischen Oberfl·achen im Bereich von
einigen m<2>/g kann die eingesetzte F·ullstoffmenge im Bereich von 35 %
bis 500 %, bezogen auf das Gewicht der organischen Substanz der
Membran, liegen. Der Vorzugsbereich f·ur hochdisperse F·ullstoffe liegt
bei 10 bis 25 Gew.-%, der f·ur F·ullstoffe mit geringeren spezifischen
Oberfl·achen bei 50 bis 200 Gew.-%.
Als Polymerkombinationen kommen beispielsweise die folgenden in Frage:
Celluloseester/Polyvinylester Polyurethan/Polyacrylderivate bzw.
Acrylcopolymere Polycarbonat-Copolymere/Polyurethan
Polyvinylderivate/Polysulfone Polyamide bzw. Polyimide/Polystyrol bzw.
Styrolcopolymere Poly-para-dimethyl-phenylenoxid/Polyvinylidenfluorid
Polysulfon/Polyacrylnitril Polyethersulfon / anionisch modifiziertes
Polyacrylnitril.
Es sind auch weitere Kombinationen aus den genannten Polymersystemen
m·oglich, die weiterhin zu tern·aren Polymergemischen erweitert werden
k·onnen.
Konkrete Beispiele solcher Polymerkombinationen sind:
Celluloseacetat/Polyvinylacetat (z.B. Mowilith TM ), Polyurethan
(Desmoderm KBH TM )/Polyacrylnitril (Dralon T TM ), Desmoderm KBH TM
/Aminmodifiziertes Dralon (Dralon A TM ), Desmoderm KBH TM /Anionisch
modifiziertes Dralon (Dralon U TM ), Polysulfon (Udel P 1700 TM
)/Polyvinylidenfluorid, Polyethercarbonat/Desmoderm KBH TM , Dralon U
TM /Mowilith TM , Celluloseacetat/Dralon U TM , Celluloseacetat/Dralon
U TM /Polystyrol, Mowilith TM /Desmoderm KBH TM / Polyvinylchlorid und
Polyethersulfon (Ultrason E TM ) / Polyacrylnitril (Dralon X TM ).
Das f·ur eine Phasenseparation ohne den eindispergierten F·ullstoff
erforderliche Mengenverh·altnis der Copolymere in den jeweiligen
Kombinationen ist durch einfache Vorversuche zu ermitteln.
Ein weiteres sehr wichtiges tern·ares Polymersystem ist Desmoderm KBH
TM /Mowilith TM /Dralon T TM , wobei Dralon T TM auch durch Dralon A TM
oder Dralon U TM ersetzt sein kann. Die chemischen Strukturen der
bevorzugt eingesetzten Polymeren sind im Anhang an die
Ausf·uhrungsbeispiele beschrieben.
Zur Herstellung der Polymergiessl·osungen sind beispielsweise
Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylsulfoxid
(DMSO), Dimethylacetamid, Dioxolan, Dioxan, Aceton, Methylethylketon,
Cellosolve TM bzw. Gemische dieser L·osungsmittel geeignet.
Der Gesamtprozess der Membranherstellung l·asst sich anhand des
folgenden Beispiels darstellen: Die jeweils ca. 20 Gew.-%igen
DMF-Polymerl·osungen aus Desmoderm KBH TM , Mowilith TM und Dralon TM
werden unter Eindispergieren von Talkum mit Hilfe eines
schnelldrehenden R·uhrers (Dissolver) zu einer homogenen
Polymergiessl·osung gemischt. Nach Entgasen im Vakuum wird die
Giessl·osung mit Hilfe eines Rakels in einer Schichtdicke von
beispielsweise 150 mu m auf ein Tr·agersubstrat aufgebracht und in das
Koagulationsbad, vorzugsweise reines Wasser, getaucht. Nach einer
Verweilzeit von etwa 2 Minuten wird die dabei entstandene
Polymermembran aus dem Koagulationsbad genommen und mit warmer Luft
getrocknet.
Weitere Komponenten f·ur die Herstellung der makropor·osen Membranen
k·onnen Tenside, beispielsweise Dioctyl-natriumsulfosuccinat oder
Dodecylbenzolsulfonate sein, die in der Giessl·osung benutzt werden.
Ebenso k·onnen wasserl·osliche Polymere, wie Celluloseether,
Polyethylenglykole, Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon
Bestandteile der Polymergiessl·osung sein. Ferner kommen Zus·atze von
sogenannten Koagulationshilfsmitteln, wie beispielsweise kationische
Polyurethandispersionen, in Frage.
Die Giessl·osung wird auf einen Tr·ager aufgebracht, um die
F·allungskoagulation durchf·uhren zu k·onnen und die Giessl·osung und
das makropor·ose Polymer handhaben zu k·onnen. Solche Tr·ager k·onnen
beispielsweise Glas oder silikonisierte Tr·agermaterialien der
verschiedensten Herkunft sein. Weitere Tr·agermaterialien sind
fl·ussigkeitsdurchl·assige Polymergewebe oder Polymervliese, auf denen
die makropor·ose Polymermembran eine gute Haftung zeigt.
Makropor·ose Polymermembranen, die erfindungsgem·ass eingesetzt werden,
haben mittlere Porendurchmesser von 10 bis 50 mu m, bevorzugt 10 bis 30
mu m.
Besonders vorteilhaft bei der Durchf·uhrung immundiagnostischer
Nachweise sind Membranen, in die das Chromogen bereits im Rahmen der
Membranherstellung integriert wurde. Ein wichtiges Beispiel hierf·ur
ist das Chromogen 3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidin (TMB), das ein
bekannter Oxidationsindikator ist. Gegen·uber den bekannten
konventionellen Systemen ergeben sich zwei wichtige Vorteile: 1. Die
gesamte Testprozedur wird um den Schritt der Indikator-Impr·agnierung
verk·urzt und damit vereinfacht. Dieser Aspekt ist insofern wichtig, da
als L·osemittel f·ur viele Indikatoren, beispielsweise auch f·ur TMB,
organische L·osungsmittel eingesetzt werden, die entweder die
Polymermembran oder das biochemische Reagenzsystem sch·adigen k·onnen.
2.
Ein noch gewichtigerer Vorteil des in die Membran integrierten
Indikators ist der, dass das Ausbluten der bei der Reaktion erzeugten
Indikatorfarbe im Gegensatz zu konventionellen Systemen praktisch
vollkommen unterbunden wird.
Das erfindungsgem·asse Verfahren unter Einsatz der beschriebenen
makropor·osen Polymermembranen ergibt ·uberraschenderweise
M·oglichkeiten zur verbesserten adsorptiven und kovalenten Bindung von
biochemischen Wirkstoffen (Enzymen, Antik·orpern): a) Adsorptive
Immobilisierung Es zeigt sich ·uberraschenderweise, dass die adsorptive
Bindungseigenschaft der beschriebenen makropor·osen Polymermembranen
durch eine Modifizierung der Membranoberfl·ache mit freien Aminogruppen
erheblich gesteigert werden kann. Die Herstellung der aminmodifizierten
Membranen kann entweder durch nachtr·agliche Behandlung der fertigen
Membran oder vorzugsweise durch Zus·atze in die Polymergiessl·osung,
die zur Membranherstellung nach dem Verfahren der F·allungskoagulation
in Wasser eingesetzt wird, erfolgen. Als geeignete Zus·atze haben sich
Polymere mit freien Aminogruppen, wie beispielsweise Polyethylenimin,
erwiesen.
Als weitere Zus·atze kommen beispielsweise Polyamidamine oder andere
wasserl·osliche aminhaltige Polymere in Frage, wie sie beispielsweise
auch als Retentionsmittel bei der Papierherstellung (Das Papier 33,
Heft 10A) eingesetzt werden. Solche Retentionsmittel sind
beispielsweise unter dem Namen Retaminol TM (Bayer AG) oder Praestol TM
(Stockhausen) handels·ublich.
Obwohl solche Zus·atze wasserl·osliche Verbindungen darstellen, werden
sie ·uberraschenderweise im Verlauf der Membranherstellung durch
Koagulation in Wasser nicht extrahiert. Diese Tatsache kann durch die
Ninhydrin-Reaktion nachgewiesen werden.
Desweiteren wurde gefunden, dass aminomodifizierte Membranen in
einfacher Weise auch dadurch hergestellt werden k·onnen, dass man zur
Polymergiessl·osung aminmodifizierte F·ullstoffe zusetzt. Als solche
kommen beispielsweise in Frage: Silikat-F·ullstoffe, deren Oberfl·ache
mit Aminosilan behandelt ist. Solche Produkte werden beispielsweise als
Silbond 600 AST (Fa. Quartz-Werke) angeboten. Es hat sich dabei
gezeigt, dass besonders gute Resultate im Hinblick auf die adsorptive
Immobilisierung durch eine Kombination der Zus·atze Polyethylenimin und
mit Aminosilanen behandelten Silikaten erzielt werden. b) Kovalente
Immobilisierung Es wurde weiterhin gefunden, dass die beschriebenen
aminmodifizierten makropor·osen Polymermembranen auch f·ur eine
kovalente Fixierung der biochemischen Reagenzien hervorragend geeignet
sind.
Hierbei wurde ·uberraschenderweise gefunden, dass neben den bekannten
Kupplungsreagenzien, wie Glutardialdehyd, Carbodiimiden oder
Bishydroxysuccinimiden, sich ganz besonders wasserl·osliche
Bisulfit-Addukte von mehrfunktionellen Isocyanaten als kovalente
Ankergruppen eignen. Solche Bisulfit-Addukte und ihre Herstellung sind
bekannt (Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 14/2, S.
63-64). Sie sind durch Umsetzung von Isocyanaten mit
Natriumhydrogensulfit zug·anglich. Geeignete Isocyanate sind
vorzugsweise mehrfunktionell und k·onnen aliphatisch, cycloaliphatisch
oder aromatisch sein.
Beispiele geeigneter Polyisocyanate sind: Hexamethylendiisocyanat,
Cyclohexan-1,4-diisocyanat, 2,4-und 2,6-Toluylendiisocyanat und deren
Gemische, 1-Isocyanatomethyl-5-isocyanato-1,3,3-trimethylcyclohexan,
2,2,4- bzw. 2,4,4-Trimethylhexamethylendiisocyanat-1,6,
1,5-Naphthalin-diisocyanat, 1,3-Cyclopentylendiisocyanat, m- und
p-Phenylendiisocyanat, 2,4,6-Toluylentriisocyanat,
4,4',4''-Triphenylmethantriisocyanat, 1,3- und 1,4-Xylylendiisocyanat,
3,3'-Dimethyl-4,4'-diphenylen-diisocyanat, Duren-diisocyanat,
1-Phenoxy-2,4'-phenylendiisocyanat,
1-tert.-Butyl-2,4-phenylendiisocyanat,
Methylen-bis-4,4'-cyclohexyldiisocyanat,
1-Chlor-2,4-phenylendiisocyanat und 4,4'- Diphenylenetherdiisocyanat;
weitere, hier nicht genannte Polyisocyanate sind dem Fachmann
grunds·atzlich bekannt.
Weiterhin ist es m·oglich, h·ohermolekulare und gegebenenfalls auch
h·oherfunktionelle Polyisocyanate, die aus niedermolekularen
Grundk·orpern durch Polymerisationsreaktion zu Uretdionen oder
Isocyanuratderivaten hergestellt werden, einzusetzen. Beispielsweise
seien das Uretdion aus 2 Mol 2,4-Toluylendiisocyanat und
diisocyanuratringhaltigen Polymerisationsprodukte aus 2,4- und
2,6-Toluylendiisocyanat oder Hexamethylendiisocyanat, ein
durchschnittlich zwei Isocyanuratringe im Molek·ul enthaltendes und aus
5 Mol Toluylendiisocyanat gebildetes System oder ein entsprechendes
Derivat aus durchschnittlich 2 Mol Toluylendiisocyanat und 3 Mol
Hexamethylendiisocyanat, erw·ahnt.
Nach einer weiteren Aufbaumethode ist es m·oglich, aus Di- oder
Polyisocyanaten durch partielle Hydrolyse ·uber die Stufe der
Carbamids·aure und des Amins h·ohere biuretverkn·upfte Systeme
herzustellen, z.B. eine biuretverkn·upfte Verbindung, die formal aus 3
Mol Hexamethylendiisocyanat unter Zusatz von 1 Mol Wasser und
Abspaltung von 1 Mol Kohlendioxid entstanden ist. Ebenfalls geeignete
Polyisocyanate erh·alt man bei der Umsetzung von Di- und Polyolen mit
di- oder polyfunktionellen Isocyanaten, wenn das Molverh·altnis von
Hydroxyverbindungen zum Isocyanat so gew·ahlt wird, dass bei den
statistisch gebildeten Reaktionsprodukten stets freie NCO-Funktionen
vorhanden bleiben und ein Molgewicht von 2000 bis 3000 nicht
·uberschritten wird. ·Ahnliche geeignete Polyisocyanate erh·alt man aus
hydroxylgruppenhaltigen Polyestern durch Umsetzen mit ·ubersch·ussigen
di- oder polyfunktionellen Isocyanaten.
Alle oben beschriebenen Di- und Polyisocyanate k·onnen in dieser Weise
mit Di-und Polyolen, wie Mono- und Polyethylenglykol, Propandiolen,
Butandiolen, Neopentylglykol und anderen Pentandiolen, Adipol,
Hexandiolen, Cyclohexandiolen, 1,4-Dihydroxymethylcyclohexan,
Perhydro-bisphenol A, Glycerin, Trimethylolethan, Trimethylolpropan,
anderen Hexantriolen und Pentaerythrit, unter den beschriebenen
Voraussetzungen umgesetzt werden.
Bevorzugt werden Diisocyanate, insbesondere Hexamethylendiisocyanat,
Isophorondiisocyanat, Toluylendiisocyanat und
Diphenylmethan-diisocyanat eingesetzt.
Diese Methode der kovalenten Bindung von immunologisch aktiven
Substanzen (Enzyme, Antik·orper) auf der Membranoberfl·ache ist nicht
nur ·uberaus einfach, sondern sie bietet bez·uglich der chemischen
Struktur und der Kettenl·ange der Bindungsglieder zwischen der por·osen
Polymermembran und den aktiven Substanzen eine bei den bisher bekannten
Kupplungsreagenzien nicht bekannte Variationsbreite. Zur Durchf·uhrung
der Bindung der aktiven Substanzen stehen mehrere Verfahren zur
Verf·ugung.
So kann in einem ersten Verfahren die beschriebene Aminmodifizierte
Membran zun·achst mit einer etwa 0,1 bis 1%igen w·assrigen L·osung des
Isocyanat-Bisulfit-Addukts getr·ankt werden. Dieses Tr·anken erfolgt
beispielsweise sehr einfach durch Eintauchen der Membran in eine solche
L·osung. Danach wird die Membran unter geeigneten Bedingungen
getrocknet, beispielsweise in einem Trockenschrank bei 30 bis 80 DEG C
w·ahrend einer Zeit von 5 bis 120 Minuten. Die Fixierung immunologisch
aktiver Substanzen kann nun einfach durch Kontaktieren einer L·osung
dieser Aktivsubstanzen mit der Membranoberfl·ache erfolgen. Das
Kontaktieren geschieht beispielsweise einfach durch Impr·agnierung oder
beim Arbeiten mit Mikrotiterplatten oder Bio Bot-Apparaturen durch ein
Durchsaugen der Wirkstoffl·osung.
In einem zweiten Verfahren wird eine gemeinsame w·assrige L·osung des
Isocyanat-Bisulfit-Addukts und der zu immobilisierenden biochemisch
aktiven Substanz hergestellt und diese mit der aminmodifizierten
Membran in Kontakt gebracht. Hierbei hat sich ein ·Uberschuss des
Bisulfit-Addukts ·uber die molar erforderliche Menge, bezogen auf die
Aktivsubstanz, als vorteilhaft erwiesen.
Das erfindungsgem·asse Verfahren erlaubt die gesamte Bandbreite
immunchemischer Nachweismethoden, beispielsweise den immunologischen
Nachweis von Pathogenen f·ur Pflanze, Mensch und Tier, den Nachweis von
Wirkstoffen in Pflanze, Mensch und Tier, den Nachweis von
Verunreinigungen (beispielsweise von Pflanzenschutzmitteln) im Boden
und Grundwasser und weitere Nachweismethoden.
Die Eignung des erfindungsgem·assen Verfahrens zur Durchf·uhrung
solcher immunchemischer (immundiagnostischer) Nachweise ist in den
folgenden Beispielen n·aher erl·autert.
Die Beispiele beschreiben folgende Schritte: 1. Herstellung
aminmodifizierter makropor·oser Polymermembranen 2. Immundiagnostische
Nachweisverfahren an den Beispielen Maus IgG 3. Vergleich zwischen
adsorptiver und kovalenter Fixierung. Beispiel 1 Herstellen einer
aminmodifizierten Polymerblend-Membran
Mit Hilfe eines schnelldrehenden R·uhrers (Dissolvers) wurde aus den
folgenden Komponenten eine Polymer-Giessl·osung hergestellt:
Columns=2 Dralon T TM (Polyacrylnitril)9,6 g Desmoderm KBH TM
(Polyurethan, 20 % in NMP)170,0 g Mowilith 50 TM (Polyvinylacetat, 25 %
in NMP)225,8 g N-Methylpyrrolidon (NMP)220,0 g Silbond 600 AST
(aminmodifiziertes Silikat)293,4 g Natriumdodecylsulfat (SDS)3,9 g
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin31,3 g Polymin P TM (Polyethylenimin, 50 %
in Wasser)2,1 g
Die chemischen Strukturen der verwendeten Polymeren sind in DE-OS 3 809
523 beschrieben.
Die Giessl·osung wurde filtriert (Metallgewebe, 25 mu m Maschenweite)
und entgast. Membranherstellung
Die Herstellung einer tr·agergest·utzten Membran erfolgte nach dem
bekannten Verfahren der F·allungskoagulation in Wasser. Es wurden die
folgenden Bedingungen eingehalten:
Columns=2 Tr·agermaterial:Polyestervlies FO 2403, Fa. Freudenberg
Nassauftrag mit Rakel:300 mu m Koagulationsbad:Wasser, 40 DEG C
Trocknungsbedingungen:60 DEG C, 20 min
Dabei wurde eine auf dem Polyestervlies haftende, den Indikator
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin enthaltende makropor·ose
Polymerblend-Membran erhalten, die als Tr·agermatrix f·ur die folgenden
immunchemischen Nachweisreaktionen eingesetzt wurde. Beispiel 2
Durchf·uhrung eines Sandwich-ELISA zum Nachweis von Maus IgG
Unter Verwendung kommerziell erh·altlicher Immunglobuline wurde ein
Immuntest nach dem Sandwich-ELISA-Prinzip auf der Polymerblend-Membran
als Festphase durchgef·uhrt. Die f·ur den Immuntest verwendeten
Komponenten, prim. (F·anger-) Antik·orper, sek. (Marker-) Antik·orper,
Antigen (Maus IgG) wurden von der Firma SIGMA Chemie GmbH, Deisenhofen,
bezogen.
Im einzelnen wurden folgende Antik·orper verwendet: 1. als prim.
Antik·orper (F·angerantik·orper):
Columns=3 Head Col 1: Sigma Nr. Head Col 2: Typ Head Col 3: Ursprung M
3014a-Maus IgG ganzes Molek·ulZiege M 9637a-Maus IgG ganzes
Molek·ulKaninchen 2. als sek. Antik·orper (Markerantik·orper):
Columns=4 Head Col 1: Sigma Nr. Head Col 2: Typ Head Col 3: Ursprung
Head Col 4: Markierung A 2028a-Maus IgG ganzes
Molek·ulKaninchenPeroxidase A 4416a-Maus IgG ganzes
Molek·ulZiegePeroxidase 3. als Antigen (Maus IgG) Columns=2 Head Col 1:
Sigma Nr. Head Col 2: Typ I 5381Maus IgG
F·ur Anwendungen wurden mehrere Kombinationen von prim. und sek.
Antik·orpern verwendet.
Columns=3 Head Col 1: Prim. Antik·orper Head Col 2: Antigen Head Col 3:
Sek. Antik·orper M 3014I 5381A 2028 M 3014I 5381A 4416 M 9637I 5381A
4416
Durchf·uhrung der Immuntestverfahren: Als Rahmen f·ur die Testmembran
wurde eine Dot-Blot Apparatur von BioRad verwendet. F·ur die
Filtrationsschritte wurde ein mildes Wasserstrahlvakuum angelegt.
Die Polymerblend-Membran wurde mit 100 mu l H2O je Dot gew·assert.
Danach wurde der prim. Antik·orper mit einer Konzentration von 1 mg/ml
Wasser in einem Volumen von 400 mu l durch die Membran filtriert.
Anschliessend wurde eine Verd·unnungsreihe des Antigens (Maus IgG) in
einem Volumen von 200 mu l je Verd·unnung und unterschiedlicher
Konzentration durch die Membran gesaugt. Nach einem Waschschritt wurde
der sek. Antik·orper (POD-markiert) durch die Membran filtriert.
Abschliessend wurde einmal mit 500 mu l PBS/Tween und einmal mit 500 mu
l Wasser gewaschen und die Membran in die Substrat-L·osung f·ur das
Markerenzym zur Farbentwicklung getaucht.
Die Ergebnisse des Bindungsassay wurden in einem Taschen-Reflektometer
bestimmt.
Die Ergebnisse der Bindungsexperimente sind wie folgt dargestellt
(anh·angende Fig. 1-3): Fig. 1: System M 3014/I 5381/A 2028 Fig. 2:
System M 3014/I 5381/A 4416 Fig. 3: System M 9637/I 5381/A 4416 Das
Beispiel zeigt die hervorragende Eignung der erfindungsgem·assen
Membranmatrizes f·ur Immuntests. Der Analyt Maus IgG kann bis in den
Nanogrammbereich sicher nachgewiesen werden.
Im Beispiel 2 wurden neben Wasser noch folgende Puffersysteme
verwendet: PBS (phosphatgepufferte physiologische Kochsalzl·osung) 0,01
M Phosphat (= 0,008 M K2HPO4 und 0,002 M NaH2PO4) mit 0,15 M NaCl bei
pH 7,4.
Acetat-Puffer Substratgemisch (f·ur POD-Reaktion) 0,1 M Na-acetat in
H2O, pH 6,0 (eingestellt mit 1 M Citronens·aure); als Redoxpartner
wurde H2O2 (3,0 %) mit 1 ml je l zugegeben.
Tween 20 (Polyoxyethylensorbitan-monolaurat, Sigma Nr.: P 1379) 0,01 %
in H2O dest. Beispiel 3 (zum Vergleich) Durchf·uhrung eines
Sandwich-ELISA zum Nachweis von Maus IgG
Beispiel 2 wurde wiederholt nur mit der ·Anderung, dass als Festphase
keine erfindungsgem·asse Polymerblend-Membran verwendet wurde, sondern
eine Polyvinylidendifluoridmembran der Fa. Millipore (Immobilon P).
Die Membran wurde vor der in Beispiel 1 beschriebenen Testprozedur
durch Durchsaugen von 100 mu l Ethanol lyophilisiert. Da die Membran im
Gegensatz zu den erfindungsgem·assen Polymerblend-Membranen kein
Chromogen enth·alt, wurde sie nach der Immunreaktion in eine
Substratl·osung getaucht, die folgendermassen hergestellt wurde:
Tetramethylbenzidin wurde in einer Konzentration von 2 mg/ml in
Methanol gel·ost (Stock-L·osung). Die Substratl·osung wurde frisch aus
5 Teilen Stockl·osung, 3,75 Teilen 0,4 M Citrat-Puffer (pH 5,5), 11,3
Teilen H2O und 0,025 Teilen 30 % H2O2 hergestellt.
Die sich schnell zeigenden blauen Farbspots wurden immer gr·osser,
indifferenter und liefen teilweise ineinander ·uber. Durch Ausbluten
des Farbstoffs in die Substratl·osung f·arbte sich diese stark blau und
f·arbte so wiederum die gesamte Membran blau ein.
Nach der Trocknung der Membran war die F·arbung ausserdem nur wenige
Minuten stabil, so dass keine reflektometrische Auswertung m·oglich
war. Im Gegensatz dazu bleiben Farbspots auf den erfindungsgem·assen
Polymer-Blendmembranen mehrere Tage, h·aufig bis zu einigen Wochen
stabil und auswertbar. Beispiel 4
Immunologisch aktive Substanzen werden auf der Oberfl·ache der
erfindungsgem·assen Polymer-Blendmembranen ausreichend fest
immobilisiert. Die Immobilisierung kann durch Vorbehandlung mit
Isocyanat-Bisulfitaddukten noch verbessert werden.
Diesen Effekt demonstriert das Beispiel 4. Ein Markerantik·orper (Sigma
A 9169, Typ: a-rabbit IgG, Ursprung: Ziege, Markierung: Peroxidase)
wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, auf der Oberfl·ache einer
Polymer-Blendmembran gem·ass Beispiel 1 immobilisiert. In einem Fall
war die Membran unbehandelt und im anderen mit einer 0,2%igen
w·assrigen L·osung des Bisulfitaddukts vom Hexamethylendiisocyanat
vorbehandelt. Die Vorbehandlung wurde so durchgef·uhrt, dass die
Membran mit der Bisulfitaddukt-L·osung durch Tauchen getr·ankt und die
Membran anschliessend bei 60 DEG C 1 h in einem Umlufttrockenschrank
getrocknet wurde.
Nach Adsorption auf der Membranoberfl·ache wurde zur ·Uberpr·ufung der
Dauerhaftigkeit der Immobilisierung bis zu achtmal mit verschiedenen
Puffern und Reagenzien gewaschen und nach den jeweiligen
Waschvorg·angen mittels Enzymreaktion der eingesetzten Peroxidase (POD)
und TMB/H2O2 als Redox-Partner detektiert. In folgender Tabelle ist die
Zahl der Waschvorg·ange angegeben, nach denen man eine deutliche
Abschw·achung der Blauf·arbung erkennen kann.
Columns=7 Medium123456 Membran unbehandelt46n.a.n.a.43 Membran
vorbehandeltn.a.n.a.n.a.n.a.64
n.a. = nicht ausgewaschen
Verwendete Puffer und Reagenzien als Waschmedien: 1 = H2O 2 = H2O mit
0,1 % Tween 20 3 = PBS 4 = PBS mit 0,1 % Tween 20 5 = Acetatpuffer 6 =
Carbonatpuffer (0,1 M NaHCO3 in H2O, pH 9,6, eingestellt mit
Natronlauge) Anhang: Chemische Strukturen der bevorzugt eingesetzten
Polymeren Polyurethan (Desmoderm KBH TM , Bayer AG)
Thermoplastisches Polyaddukt, welches durch Umsetzung von 75 Teilen
eines Polyesters aus Adipins·aure, 70 Mol-% Ethylenglykol und 30 Mol-%
1,4-Butandiol (MG = 2000), 25 Teilen eines Polyesters aus Adipins·aure
und 1,4-Butandiol (MG = 2250), 25 Teilen 1,4-Butandiol und 85 Teilen
Diphenylmethandiisocyanat erhalten wurde. EMI26.1 EMI27.1